附件1

保健食品及其原料毒理學(xué)評價(jià)程序

（征求意見(jiàn)稿）

本程序適用于保健食品及其原料的毒理學(xué)安全性評價(jià)。

1 術(shù)語(yǔ)

1.1 保健食品

是指聲稱(chēng)保健功能，不得對人體產(chǎn)生急性、亞急性或者慢性危害的特殊食品。包括屬于補充維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養物質(zhì)的營(yíng)養素補充劑，以及聲稱(chēng)保健功能的產(chǎn)品。

1.2 保健食品原料

形成保健食品功效成分和配方的初始物料。

2受試物

2.1 受試物可以是保健食品或保健食品原料。

2.2 資料性要求

2.2.1應提供受試物的名稱(chēng)、性狀、規格、批號、生產(chǎn)日期、保質(zhì)期、保存條件、申請單位名稱(chēng)、生產(chǎn)企業(yè)名稱(chēng)、配方、生產(chǎn)工藝、質(zhì)量標準、保健功能以及推薦攝入量等信息。

2.2.2 受試物為保健食品原料時(shí)應提供動(dòng)物和植物類(lèi)原料的產(chǎn)地和食用部位、微生物類(lèi)原料的分類(lèi)學(xué)地位和生物學(xué)特征、食用條件和方式、食用歷史、食用人群等基本信息，以及其他有助于安全性評估的資料。

2.2.3原料為從動(dòng)物、植物、微生物中分離的成分時(shí)，還需提供該成分的理化特性和化學(xué)結構等資料。

2.2.4 提供受試物的主要成分、功效成分/標志性成分及可能的有害成分的分析報告。

2.3 受試物的特殊要求

2.3.1保健食品應提供包裝完整的定型產(chǎn)品。毒理學(xué)試驗所用樣品批號應與功能學(xué)試驗所用樣品批號一致，并且為衛生學(xué)試驗所用三批樣品之一（益生菌、奶制品等產(chǎn)品保質(zhì)期短于整個(gè)試驗周期的產(chǎn)品除外）。根據技術(shù)審評意見(jiàn)要求補做試驗的，若原批號樣品已過(guò)保質(zhì)期，可使用新批號的樣品實(shí)驗，但應提供新批號樣品按產(chǎn)品技術(shù)要求檢驗的全項目檢驗報告。

2.3.2 由于推薦量較大等原因不適合直接以定型產(chǎn)品進(jìn)行試驗時(shí)，可以對送檢樣品適當處理，如濃縮、部分去除輔料或已知安全的食品成分等。應提供受試樣品處理過(guò)程的說(shuō)明和相應的證明文件，處理過(guò)程應與原保健食品的主要生產(chǎn)工藝步驟保持一致。

3. 毒理學(xué)試驗的主要項目

依據GB15193開(kāi)展下列試驗。

3.1急性經(jīng)口毒性試驗

3.2遺傳毒性試驗：細菌回復突變試驗，體內哺乳動(dòng)物紅細胞微核試驗，哺乳動(dòng)物骨髓細胞染色體畸變試驗，小鼠精原細胞或精母細胞染色體畸變試驗，體外哺乳類(lèi)細胞HGPRT基因突變試驗，體外哺乳類(lèi)細胞TK基因突變試驗，體外哺乳類(lèi)細胞染色體畸變試驗、嚙齒類(lèi)動(dòng)物顯性致死試驗，體外哺乳類(lèi)細胞DNA損傷修復（非程序性DNA合成）試驗，果蠅伴性隱性致死試驗。

遺傳毒性試驗組合：一般應遵循原核細胞與真核細胞、體內與體外試驗相結合的原則，并包括不同的終點(diǎn)（誘導基因突變、染色體結構和數量變化），推薦下列遺傳毒性試驗組合：

組合一：細菌回復突變試驗；哺乳動(dòng)物紅細胞微核試驗或哺乳動(dòng)物骨髓細胞染色體畸變試驗；小鼠精原細胞或精母細胞染色體畸變試驗或嚙齒類(lèi)動(dòng)物顯性致死試驗。

組合二：細菌回復突變試驗；哺乳動(dòng)物紅細胞微核試驗或哺乳動(dòng)物骨髓細胞染色體畸變試驗；體外哺乳類(lèi)細胞染色體畸變試驗或體外哺乳類(lèi)細胞TK基因突變試驗。

根據受試物的特點(diǎn)也可用其他體外或體內測試替代推薦組合中的一個(gè)或多個(gè)體外測試。

3.3 28天經(jīng)口毒性試驗

3.4 致畸試驗

3.5 90天經(jīng)口毒性試驗

3.6生殖毒性試驗

3.7毒物動(dòng)力學(xué)試驗

3.8慢性毒性試驗

3.9致癌試驗

3.10 慢性毒性和致癌合并試驗

4. 毒性試驗的選擇

4.1 保健食品原料

需要開(kāi)展安全性評價(jià)的保健食品原料應參照新食品原料安全性審查的有關(guān)規定進(jìn)行。

4.2 保健食品

4.2.1保健食品一般應進(jìn)行急性經(jīng)口毒性試驗、三項遺傳毒性試驗和28天經(jīng)口毒性試驗。根據實(shí)驗結果和目標人群決定是否增加90天經(jīng)口毒性試驗、致畸試驗和生殖毒性試驗、慢性毒性和致癌試驗及毒物動(dòng)力學(xué)試驗。

4.2.2采用導致物質(zhì)基礎發(fā)生重大改變等非傳統工藝生產(chǎn)的保健食品，應進(jìn)行急性經(jīng)口毒性試驗、三項遺傳毒性試驗、90天經(jīng)口毒性試驗和致畸試驗，必要時(shí)開(kāi)展其他毒性試驗。

4.2.3 以普通食品、保健食品原料目錄內的物質(zhì)為原料，僅采用物理粉碎或水提等傳統食品生產(chǎn)工藝生產(chǎn)、食用方法與傳統食用方法相同，且原料推薦食用量為常規用量或符合國家相關(guān)食品用量規定的保健食品，一般可不開(kāi)展毒性試驗。

5. 特定產(chǎn)品的毒理學(xué)設計要求

5.1 如產(chǎn)品配方中含有人體必需營(yíng)養素或已知存在安全問(wèn)題等物質(zhì)，如某一過(guò)量攝入易產(chǎn)生安全性問(wèn)題的人體必需營(yíng)養素等物質(zhì)（如維生素A、硒等）或已知存在安全問(wèn)題物質(zhì)（如咖啡因等），在按其推薦量設計試驗劑量時(shí)，如該物質(zhì)的劑量達到已知的毒性作用劑量，在原有劑量設計的基礎上，應考慮增設去除該物質(zhì)或降低該物質(zhì)劑量（如降至未觀(guān)察到有害作用劑量）的受試物劑量組，以便對受試物中其他成分的毒性作用及該物質(zhì)與其他成分的聯(lián)合毒性作用做出評價(jià)。

5.2推薦量較大的含乙醇的受試物，在按其推薦量設計試驗劑量時(shí)，如超過(guò)動(dòng)物最大灌胃容量，可以進(jìn)行濃縮。乙醇濃度低于15％（V/V)的受試物，濃縮后應將乙醇恢復至受試物定型產(chǎn)品原來(lái)的濃度。乙醇濃度高于15％的受試物，濃縮后應將乙醇濃度調整至15％，并將各劑量組的乙醇濃度調整一致。不需要濃縮的受試物，其乙醇濃度高于15％時(shí)，應將各劑量組的乙醇濃度調整至15％。在調整受試物的乙醇濃度時(shí)，原則上應使用生產(chǎn)該受試物的酒基，無(wú)法達到定型產(chǎn)品的濃度時(shí)，可用食用酒精。

5.3針對適宜人群為孕婦、乳母或兒童的產(chǎn)品，應特別關(guān)注是否存在生殖毒性和發(fā)育毒性，必要時(shí)還需檢測某些神經(jīng)毒性和免疫毒性指標。

5.4對益生菌、真菌等有特殊規定的保健食品，應按規定增加相應的試驗，如毒力試驗。

6.動(dòng)物實(shí)驗設計共性問(wèn)題

6.1 受試物的前處理

6.1.1 袋泡茶類(lèi)受試物的提取方法應與產(chǎn)品推薦飲用的方法相同，可用該受試物的水提取物進(jìn)行試驗。如果產(chǎn)品無(wú)特殊推薦飲用方法，水提取物可采用以下提取條件進(jìn)行：常壓、溫度80 ℃～90 ℃，浸泡時(shí)間30 min，水量為受試物質(zhì)量的10倍或以上，提取2次，將提取液合并濃縮至所需濃度，并標明該濃縮液與原料的比例關(guān)系。如產(chǎn)品有特殊推薦服用方法（如推薦食用浸泡后的產(chǎn)品），在試驗時(shí)予以考慮。

6.1.2  液體受試物需要進(jìn)行濃縮處理時(shí)，應采用不破壞其中有效成分的方法?？墒褂脺囟?/span>60 ℃～70 ℃ 減壓或常壓蒸發(fā)濃縮、冷凍干燥等方法。液體受試物經(jīng)濃縮后達到人體推薦量的試驗要求，但不能通過(guò)灌胃給予的，容許以摻入飼料的方式給予實(shí)驗動(dòng)物。 

6.1.3不易粉碎的固體受試物（如含膠基、蜜餞類(lèi)）可用凍干粉碎的方式處理，并在試驗報告中詳細說(shuō)明。

6.1.4含益生菌或其他微生物的受試物在進(jìn)行細菌回復突變試驗或體外細胞試驗時(shí)，應將微生物滅活，并說(shuō)明具體方法。

6.1.5對人體推薦量較大的受試物，在按其推薦量設計試驗劑量時(shí)，如超過(guò)動(dòng)物的最大灌胃容量或超過(guò)摻入飼料中的限量（10％（w/w）），可允許去除無(wú)安全問(wèn)題的部分輔料進(jìn)行試驗，并在試驗報告中詳細說(shuō)明。

6.1.6吸水膨脹率較高的受試物應考慮吸水膨脹對受試物給予劑量和實(shí)驗動(dòng)物的影響，以此來(lái)選擇合適的受試物給予方式（灌胃或摻入飼料）。如采用灌胃方式給予，應選擇水為溶媒。

6.2受試物的給予方式

6.2.1 受試物應經(jīng)口給予。根據受試物的性質(zhì)及人體推薦攝入量，選擇摻入飼料或飲水、灌胃的方式給予受試物。應詳細說(shuō)明受試物配制方法、給予方法和時(shí)間。

6.2.2 灌胃給予受試物時(shí)，應根據試驗的特點(diǎn)和受試物的理化性質(zhì)選擇適合的溶媒（溶劑、助懸劑或乳化劑），將受試物溶解或懸浮于溶媒中，一般可選用蒸餾水、植物油、淀粉、明膠、羧甲基纖維素、蔗糖脂肪酸酯等，如使用其他溶媒應說(shuō)明理由。所選用的溶媒本身應不產(chǎn)生毒性作用；與受試物各成分之間不發(fā)生化學(xué)反應，且保持其穩定性；無(wú)特殊刺激性或氣味。

6.2.3 摻入飼料或飲水方式給予受試物時(shí)，應保證受試物的穩定性和均一性及飼料的適口性，以不影響動(dòng)物攝食、營(yíng)養均衡和飲水量為原則。當受試物在飼料中的最大加入量超過(guò)5%（w/w）時(shí)，需考慮動(dòng)物的營(yíng)養需要，結合受試物的蛋白質(zhì)含量將各組飼料蛋白質(zhì)水平調整一致，并說(shuō)明具體調整方法。原則上添加的受試物最高不超過(guò)飼料的10%（w/w），否則應說(shuō)明理由。

6.3實(shí)驗動(dòng)物的選擇

實(shí)驗動(dòng)物應符合相應國家標準的要求，同時(shí)結合保健功能（如減肥、輔助降血脂等）的特點(diǎn)來(lái)選擇實(shí)驗動(dòng)物的品系、性別和年齡等。

7. 試驗結果的判定與應用

7.1 急性毒性試驗

如LD₅₀小于人的推薦（可能）攝入量的100倍，則一般應放棄該受試物用于保健食品，不再繼續進(jìn)行其他毒理學(xué)試驗。

7.2 遺傳毒性試驗

7.2.1如三項試驗均為陰性，則可繼續進(jìn)行下一步的毒性試驗。

7.2.2如遺傳毒性試驗組合中兩項或以上試驗陽(yáng)性，則表示該受試物很可能具有遺傳毒性和致癌作用，一般應放棄該受試物應用于保健食品。

7.2.3 如遺傳毒性試驗組合中一項試驗為陽(yáng)性，根據其遺傳毒性終點(diǎn)、結合受試物的結構分析、化學(xué)反應性、生物利用度、代謝動(dòng)力學(xué)、靶器官等資料綜合分析，再選兩項備選試驗（至少一項為體內試驗）。如再選的試驗均為陰性，則可繼續進(jìn)行下一步的毒性試驗；如其中有一項試驗陽(yáng)性，則應放棄該受試物應用于保健食品。

7.3  28天經(jīng)口毒性試驗

對只需要進(jìn)行急性毒性、遺傳毒性和28天經(jīng)口毒性試驗的受試物，若試驗未發(fā)現有明顯毒性作用，綜合其他各項試驗結果可做出初步評價(jià)；若試驗中發(fā)現有明顯毒性作用，尤其是有劑量—反應關(guān)系時(shí)，則一般應放棄該受試物用于保健食品。

7.4 90天經(jīng)口毒性試驗

根據試驗所得的未觀(guān)察到有害作用劑量進(jìn)行評價(jià)，原則是：

a)未觀(guān)察到有害作用劑量小于或等于人的推薦（可能）攝入量的100倍表示毒性較強，一般應放棄該受試物用于保健食品。

b)未觀(guān)察到有害作用劑量大于100倍而小于300倍者，應進(jìn)行慢性毒性試驗。

c)未觀(guān)察到有害作用劑量大于或等于300倍者則不必進(jìn)行慢性毒性試驗，可進(jìn)行安全性評價(jià)。

7.5致畸試驗

根據試驗結果評價(jià)受試物是不是實(shí)驗動(dòng)物的致畸物。若致畸試驗結果陽(yáng)性則不再繼續進(jìn)行生殖毒性試驗和生殖發(fā)育毒性試驗。在致畸試驗中觀(guān)察到的其他發(fā)育毒性，應結合28天和（或）90天經(jīng)口毒性試驗結果進(jìn)行評價(jià)。

7.6生殖毒性試驗和生殖發(fā)育毒性試驗

根據試驗所得的未觀(guān)察到有害作用劑量進(jìn)行評價(jià)，原則是：

a)未觀(guān)察到有害作用劑量小于或等于人的推薦（可能）攝入量的100倍表示毒性較強，應放棄該受試物用于保健食品。

b)未觀(guān)察到有害作用劑量大于100倍而小于300倍者，應進(jìn)行慢性毒性試驗。

c) 未觀(guān)察到有害作用劑量大于或等于300倍者則不必進(jìn)行慢性毒性試驗，可進(jìn)行安全性評價(jià)。

7.7 慢性毒性和致癌試驗

7.7.1根據慢性毒性試驗所得的未觀(guān)察到有害作用劑量進(jìn)行評價(jià)的原則是：

a)未觀(guān)察到有害作用劑量小于或等于人的推薦（可能）攝入量的50倍者，表示毒性較強，應放棄該受試物用于保健食品。

b)未觀(guān)察到有害作用劑量大于50倍而小于100倍者，經(jīng)安全性評價(jià)后，決定該受試物可否用于食品。

c)未觀(guān)察到有害作用劑量大于或等于100倍者，則可考慮允許使用于保健食品。 

7.7.2根據致癌試驗所得的腫瘤發(fā)生率、潛伏期和多發(fā)性等進(jìn)行致癌試驗結果判定的原則是（凡符合下列情況之一，可認為致癌試驗結果陽(yáng)性。若存在劑量反應關(guān)系，則判斷陽(yáng)性更可靠）：

a)腫瘤只發(fā)生在試驗組動(dòng)物，對照組中無(wú)腫瘤發(fā)生。

b)試驗組與對照組動(dòng)物均發(fā)生腫瘤，但試驗組發(fā)生率高。

c)試驗組動(dòng)物中多發(fā)性腫瘤明顯，對照組中無(wú)多發(fā)性腫瘤，或只是少數動(dòng)物有多發(fā)性腫瘤。

d)試驗組與對照組動(dòng)物腫瘤發(fā)生率雖無(wú)明顯差異，但試驗組中發(fā)生時(shí)間較早。

致癌試驗結果陽(yáng)性應放棄將該受試物用于保健食品。

8.安全性綜合評價(jià)時(shí)需要考慮的因素

8.1 試驗指標的統計學(xué)意義、生物學(xué)意義和毒理學(xué)意義

對實(shí)驗中某些指標的異常改變，應根據試驗組與對照組指標是否有統計學(xué)差異、其有無(wú)劑量反應關(guān)系、同類(lèi)指標橫向比較、兩種性別的一致性及與本實(shí)驗室的歷史性對照值范圍等，綜合考慮指標差異有無(wú)生物學(xué)意義，并進(jìn)一步判斷是否具毒理學(xué)意義。此外，如在受試物組發(fā)現某種在對照組沒(méi)有發(fā)生的腫瘤，即使與對照組比較無(wú)統計學(xué)意義，仍要給予關(guān)注。

8.2 人體推薦（可能）攝入量較大的受試物

一方面，若受試物摻入飼料的最大加入量（原則上最高不超過(guò)飼料的10%）或液體受試物經(jīng)濃縮后仍達不到未觀(guān)察到有害作用劑量為人體推薦（可能）攝入量的規定倍數時(shí)，綜合其他的毒性試驗結果和實(shí)際食用或飲用量進(jìn)行安全性評價(jià)。另一方面，應考慮給予受試物量過(guò)大時(shí)，可能通過(guò)影響營(yíng)養素攝入量及其生物利用率、從而導致某些與受試物無(wú)關(guān)的毒理學(xué)表現。

8.3時(shí)間-毒性效應關(guān)系

對由受試物引起實(shí)驗動(dòng)物的毒性效應進(jìn)行分析評價(jià)時(shí)，要考慮在同一劑量水平下毒性效應隨時(shí)間的變化情況。

8.4 人群資料

由于存在著(zhù)動(dòng)物與人之間的物種差異，在評價(jià)食品的安全性時(shí)，應盡可能收集人群接觸受試物后的反應資料。人體的毒物動(dòng)力學(xué)或代謝資料對于將動(dòng)物試驗結果推論到人具有很重要的意義。

8.5 動(dòng)物毒性試驗和體外試驗資料

本程序所列的各項動(dòng)物毒性試驗和體外試驗系統是目前管理（法規）毒理學(xué)評價(jià)水平下所得到的最重要的資料，也是進(jìn)行安全性評價(jià)的主要依據。結合其他來(lái)源于計算機分析、體外試驗或體內試驗的相關(guān)資料，有助于更加全面地解釋實(shí)驗結果、做出科學(xué)的評價(jià)。

8.6 不確定系數

即安全系數。將動(dòng)物毒性試驗結果外推到人時(shí)，鑒于動(dòng)物與人的物種和個(gè)體之間的生物學(xué)差異，不確定系數通常為100，但可根據受試物的原料來(lái)源、理化性質(zhì)、毒性大小、代謝特點(diǎn)、蓄積性、接觸的人群范圍、食品中的使用量和人的可能攝入量、使用范圍及功能等因素來(lái)綜合確定其安全系數的大小。

8.7毒物動(dòng)力學(xué)試驗的資料

毒物動(dòng)力學(xué)試驗是對化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行毒理學(xué)評價(jià)的一個(gè)重要方面，因為不同化學(xué)物質(zhì)、劑量大小，在毒物動(dòng)力學(xué)或代謝方面的差別往往對毒性作用影響很大。在毒性試驗中，原則上應盡量使用與人具有相同毒物動(dòng)力學(xué)或代謝模式的動(dòng)物種系來(lái)進(jìn)行試驗。研究受試物在實(shí)驗動(dòng)物和人體內吸收、分布、排泄和生物轉化方面的差別，對于將動(dòng)物試驗結果外推到人和降低不確定性具有重要意義。

9. 再評價(jià)

安全性評價(jià)的依據不僅僅是安全性毒理學(xué)試驗的結果，而且與當時(shí)的科學(xué)水平、技術(shù)條件以及社會(huì )經(jīng)濟、文化因素有關(guān)。因此，隨著(zhù)時(shí)間的推移，社會(huì )經(jīng)濟的發(fā)展、科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，當對原料或產(chǎn)品的安全性研究有新的科學(xué)認識時(shí)，應結合產(chǎn)品上市后營(yíng)銷(xiāo)過(guò)程中發(fā)現的任何安全問(wèn)題以及管理機構采取的與安全有關(guān)的任何管理措施，對產(chǎn)品的安全性進(jìn)行重新評價(jià)。 

附件2

保健食品用菌種致病性評價(jià)程序

（征求意見(jiàn)稿）

1范圍

本程序規定了保健食品生產(chǎn)用菌種（包括細菌、絲狀真菌和酵母）的致病性評價(jià)程序。

本程序規定了作為保健食品的活性成分（活菌）和作為保健食品生產(chǎn)發(fā)酵用菌株兩類(lèi)微生物的致病性評價(jià)。

本程序適應于保健食品申請審批時(shí)對生產(chǎn)用菌種的致病性評價(jià)，對用擬評價(jià)菌種生產(chǎn)的產(chǎn)品中其他成分的評價(jià)，應參照國家相關(guān)規定進(jìn)行。

本程序不適應于基因修飾微生物的致病性評價(jià)。

2術(shù)語(yǔ)和定義

2.1致病性，Pathogenicity

微生物感染宿主造成健康損害引起疾病的能力。

2.2 產(chǎn)毒能力，Toxigenicity

微生物產(chǎn)生對人和動(dòng)物有毒作用的活性代謝產(chǎn)物的能力。

2.3毒性， Toxicity

   微生物有毒代謝產(chǎn)物引起的宿主健康損傷。

3擬評價(jià)微生物菌種的基本要求

3.1基本信息

菌種名稱(chēng)(包括學(xué)名、俗名、拉丁名等)、來(lái)源及用途。

3.2菌種分類(lèi)學(xué)資料

提供由有菌種鑒定資質(zhì)的檢驗機構出具的對擬評價(jià)菌種規范、科學(xué)的分類(lèi)學(xué)（屬、種、株名稱(chēng)或株號）資料。細菌的分類(lèi)和命名應遵循原核生物系統學(xué)國際委員會(huì )（International Committee on Systematics of Prokaryotes）的規定，并符合原核生物國際命名法規（International Code of Nomenclature of Prokaryotes）要求。真菌的分類(lèi)和命名應遵循國際藻類(lèi)、真菌和植物命名法規（International Code of Nomenclature for algae, fungi, and plants）進(jìn)行。

3.3菌種鑒定資料

根據目前已有的知識，提供基于表型或最新基因測序技術(shù)確切鑒定到種水平的資料。

3.4菌種生長(cháng)環(huán)境條件資料

提供菌種生長(cháng)最適培養基及培養條件（培養時(shí)間、培養溫度和濕度、光照等），以及菌種保藏及復壯方法等。

3.5誘變菌種

經(jīng)誘變的菌種還需提供詳細的誘變方法（包括使用的誘變劑、誘變條件及誘變實(shí)驗流程等）。

3.6生產(chǎn)相關(guān)信息

包括但不限于安全用于保健食品工業(yè)生產(chǎn)的記錄、工藝流程、企業(yè)標準等資料。

3.7 其他國家審批資料

    提供其他國家批準擬評價(jià)菌種作為保健食品或普通食品生產(chǎn)使用的資料；

3.8其他需要說(shuō)明的信息。

4評價(jià)方法

4.1 國內外安全性評價(jià)資料綜述

基于國內外文獻數據，提供擬評價(jià)菌種的國內外使用歷史、安全性評價(jià)資料，包括其致病性和產(chǎn)毒能力的報告、科技文獻或綜述等；若無(wú)擬評價(jià)菌種的上述資料，應提供同種內其他菌株或與其相近種屬的安全性評價(jià)資料。

4.2全基因組測序(Whole Genome Sequencing, WGS)

4.2.1基因測序

對擬評價(jià)菌株進(jìn)行全基因組測序，提供包括但不限于以下信息：

-DNA提取方法

-測序方案及儀器設備

-序列組裝方法

-序列質(zhì)量評價(jià)

-FASTA 文件

-與預期基因組大小相關(guān)的contigs總長(cháng)度

-基因注釋流程

-對真菌而言，還需提供從相關(guān)數據庫中獲得的注釋質(zhì)量信息。

4.2.2 基因序列分析

將擬評價(jià)菌株的基因組序列與已有的數據庫（包括但不限于VFDB、PAI DB、MvirDB、CGE等）最新版本中存儲的序列進(jìn)行比對，并分析擬評價(jià)菌種遺傳物質(zhì)中與致病相關(guān)的已知毒力因子、毒素代謝基因的存在情況。至少提供包括以下信息的分析報告：

-毒力（或產(chǎn)毒相關(guān)）基因名稱(chēng)、所在位置、與最新數據庫中已有毒力基因的匹配度等信息

-編碼的蛋白及序列號

-毒力因子（毒素產(chǎn)生、侵襲和粘附因子等）

-同源百分比和e值

-數據庫中已充分描述過(guò)的菌株名稱(chēng)

- 基因組圖譜

- 擬評價(jià)的真菌菌種還應根據文獻報道能夠產(chǎn)生的毒素類(lèi)別，針對性檢索是否存在毒素合成關(guān)鍵基因。

4.3動(dòng)物致病性試驗

由有菌種致病性檢測和評價(jià)資質(zhì)的機構，按照附錄A、B和C實(shí)驗方案進(jìn)行保健食品用擬評價(jià)細菌、真菌、酵母菌種對動(dòng)物的致病性實(shí)驗、評價(jià)并出具報告。

4.4 產(chǎn)毒實(shí)驗

對某些能夠產(chǎn)生真菌毒素的真菌，應在多種基質(zhì)（單品種固體、多品種固體復合、不同成分液體組合等）中進(jìn)行產(chǎn)毒實(shí)驗，并按照國家標準檢測方法或國際組織/相關(guān)國家規定的標準檢測方法進(jìn)行有毒活性代謝產(chǎn)物含量檢測。

根據到目前為止我國已批準可用于保健食品的真菌名單，用于保健食品生產(chǎn)用的紅曲霉屬應進(jìn)行桔青霉素產(chǎn)毒實(shí)驗。

5結果判定

5.1出現以下結果一個(gè)以上者，則認為菌株的致病風(fēng)險較低，可作為保健食品生產(chǎn)用菌種

5.1.1三個(gè)以上國家批準作為食品或保健食品用菌種且具有長(cháng)期（30年以上）的使用歷史。

5.1.2全基因序列分析結果顯示不存在已知的毒力相關(guān)基因或毒素合成關(guān)鍵基因；

5.1.3動(dòng)物實(shí)驗顯示無(wú)致病性，

5.1.4產(chǎn)毒實(shí)驗結果顯示在受試的基質(zhì)中均不產(chǎn)生有毒活性代謝產(chǎn)物。

5.2出現以下結果之一者，則認為具有致病風(fēng)險，不能作為保健食品生產(chǎn)用菌種

5.2.1根據現有知識，全基因序列分析發(fā)現存在已知毒力基因（或毒素合成關(guān)鍵基因）；

5.2.2動(dòng)物試驗結果顯示有致病性；

5.2.3產(chǎn)毒實(shí)驗顯示在受試的任何一種基質(zhì)中可產(chǎn)生有毒活性代謝產(chǎn)物。

5.3其他需要綜合判斷的情況

5.3.1全基因序列中發(fā)現存在已知毒力基因（或毒素合成關(guān)鍵基因），但動(dòng)物實(shí)驗顯示不具有致病性，或產(chǎn)毒實(shí)驗未檢測到已知的有毒活性代謝產(chǎn)物；

5.3.2全基因測序列中未發(fā)現存在已知的毒力基因（或毒素合成關(guān)鍵基因），但動(dòng)物實(shí)驗顯示具有致病性，產(chǎn)毒實(shí)驗未檢測到已知的有毒活性代謝產(chǎn)物；

出現上述情況之一者，需結合國內外使用歷史和安全性評價(jià)資料、國內外文獻綜述、生產(chǎn)工藝、生產(chǎn)條件、終產(chǎn)品中生產(chǎn)菌種的存在情況等進(jìn)行綜合判斷。 

附錄A

(規范性附錄)

    保健食品用細菌致病性試驗方法

1  范圍

    本方法規定了保健食品用細菌的致病性試驗方法。

    本方法適用于保健食品用細菌的致病性評價(jià)。

2  設備和材料

除微生物實(shí)驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：

2.1  恒溫培養箱：36 ℃±1 ℃。

2.2  電子天平：感量0.1 g。

2.3  錐形瓶：容量500 mL。

2.4  無(wú)菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）。

2.5  無(wú)菌試管：16×160 mm。

2.6  顯微鏡：10×～100×。

2.7  微量移液器及槍頭：1.0 mL。

2.8  注射器：1.0 mL。

2.9  小鼠灌胃針頭。

2.10 厭氧培養裝置：厭氧罐、厭氧箱。

2.11 Class II生物安全柜

3  培養基和試劑

3.1  0.85%無(wú)菌生理鹽水：商品化的生理鹽水，或8.5gNaCl溶于1000mL生流水中，121℃高壓滅菌15 min，備用。

3.2  LB肉湯培養基：商品化培養基按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)用蒸餾水配制，充分加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌15 min，制備LB肉湯培養基，備用。

3.3  LB瓊脂平板：商品化培養基按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)配用蒸餾水制，充分加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌15 min，制備LB瓊脂平板，備用。

3.4  MRS肉湯培養基：商品化培養基按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)用蒸餾水配制，充分加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌15 min，制備MRS肉湯培養基，備用。

3.5  MRS瓊脂平板：商品化培養基按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)用蒸餾水配制，充分加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌15 min，制備MRS瓊脂平板，備用。

3.6 雙歧桿菌瓊脂平板：商品化培養基按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)用蒸餾水配制，充分加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌15 min，制備雙歧桿菌瓊脂平板，備用。

4  實(shí)驗動(dòng)物

選用昆明或ICR健康小鼠，雌雄各半，體重18.0g～22.0 g。

5 操作步驟

    所有擬評價(jià)的菌株均必須進(jìn)行腹腔注射和經(jīng)口灌胃兩種途徑染毒動(dòng)物，評價(jià)菌株對動(dòng)物的致病性。

5.1腹腔注射

5.1.1菌種活化與菌懸液制備

到目前為止我國批準的可用于保健食品的細菌菌種主要是雙歧桿菌和乳桿菌，新的申報菌種在以下描述中歸為其他細菌。

根據菌種的培養特征，將雙歧桿菌和乳桿菌接種MRS肉湯、其它細菌接種LB肉湯，并置適宜的培養條件下（包括培養溫度、濕度，厭氧、需氧、微需氧等）培養一定時(shí)間后，將雙歧桿菌接種MRS瓊脂平板或雙歧桿菌瓊脂平板，乳桿菌接種MRS瓊脂平板，其他細菌接種LB瓊脂平板，培養一定時(shí)間后，刮取平板上的菌落，將其懸浮于無(wú)菌生理鹽水中，充分混勻后，用適量無(wú)菌生理鹽水調整菌懸液濃度，用比濁法使菌懸液中菌體細胞的最終濃度不低于5.0×10⁷ CFU/mL。

5.1.2 腹腔注射

小鼠40只，雌雄各半，分別隨機分成4組（每組10只），包括雄性小鼠菌懸液滅活對照組、雄性小鼠菌懸液組、雌性小鼠菌懸液滅活對照組、雌性小鼠菌懸液組。每只小鼠注射0.2 mL，使每只小鼠注射菌量至少10⁷ CFU/只。

5.1.3動(dòng)物觀(guān)察

動(dòng)物腹腔注射后每天觀(guān)察1次，至少觀(guān)察21 d。

觀(guān)察動(dòng)物出現下列（但不限于）異常的情況：（1）皮膚和毛；（2）眼睛和粘膜；（3）呼吸系統；（4）肢體活動(dòng)；（5）行為方式；（6）特別注意觀(guān)察出現振顫、抽搐、腹瀉、嗜睡、流涎和昏迷等現象；（7）體重：注射前及注射后每周所有小鼠稱(chēng)量，并測量實(shí)驗期間死亡的、最終處死的小鼠體重。若小鼠的存活時(shí)間超過(guò)1d，記錄其體重變化；（8）盡可能精確記錄小鼠的死亡時(shí)間。

5.2  經(jīng)口灌胃

5.2.1菌種活化與菌懸液制備

 除制備菌懸液濃度不小于2.5×10⁸ CFU/mL外，其他操作步驟同5.1.1。

5.2.2 灌胃

小鼠40只，雌雄各半，分別隨機分成4組（每組10只），包括雄性小鼠菌懸液滅活對照組、雄性小鼠菌懸液組、雌性小鼠菌懸液滅活對照組、雌性小鼠菌懸液組，分別以2.0 mL/100g·BW的劑量給小鼠灌胃，灌胃前應禁食一夜，灌胃后3～4h喂食。

5.2.3 觀(guān)察

同5.1.3 。

6  結果與報告

對5.1和5.2的實(shí)驗結果進(jìn)行統計學(xué)分析，并進(jìn)行評價(jià)，包括：

擬評價(jià)菌株對動(dòng)物體重的影響是否有統計學(xué)意義；

動(dòng)物出現異常特征的時(shí)間及癥狀描述、出現異常的動(dòng)物數目等，包括每只動(dòng)物的死亡時(shí)間；

受試物組動(dòng)物在實(shí)驗期間未出現中毒癥狀或死亡，且對其生長(cháng)發(fā)育等影響無(wú)統計學(xué)意義，即可判定該菌種無(wú)致病性；受試物組動(dòng)物在試驗期間出現中毒癥狀或死亡，或試驗期間影響其生長(cháng)發(fā)育，即可判定該菌種具有致病性。

 附錄B

(規范性附錄)

    保健食品用絲狀真菌的致病性試驗方法

1  范圍

    本方法規定了保健食品用絲狀真菌的致病性試驗方法。

    本方法適用于保健食品用絲狀真菌的致病性評價(jià)。

2  設備和材料

除微生物實(shí)驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：

2.1  培養箱：28 ℃±1 ℃。

2.2  電子天平：感量0.1 g。

2.3  錐形瓶：容量500 mL。

2.4  無(wú)菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）。

2.5  顯微鏡：10×～100×。

2.6  微量移液器及槍頭：1.0 mL。

2.8  比濁儀。

2.9  注射器：1.0 mL。

2.10 小鼠灌胃針頭。

2.11 接種針。

2.11 Class II生物安全柜

3  培養基和試劑

3.1  麥芽汁瓊脂平板：商品化培養基按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)用蒸餾水配制，充分加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌15 min，制備麥芽汁瓊脂平板，備用。

3.2  馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板：商品化培養基按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)用蒸餾水配制，充分加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌15 min，制備馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板，備用。

3.3 0.85%無(wú)菌生理鹽水：商品化的生理鹽水，或8.5gNaCl溶于1000mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15 min，備用。

4  實(shí)驗動(dòng)物

選用昆明或ICR健康小鼠，雌雄各半，體重18.0g～22.0 g。

5  操作步驟

    所有擬評價(jià)的菌株均必須進(jìn)行腹腔注射和經(jīng)口灌胃兩種途徑染毒動(dòng)物，評價(jià)菌株對動(dòng)物的致病性。

5.1 腹腔注射

5.1.1 菌種活化與菌懸液制備

將送檢菌種接種于適宜的培養基上，到目前為止我國批準的可用于保健食品的真菌菌種除了紅曲霉屬菌種接種麥芽汁瓊脂平板外，其他菌種均接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板，28℃±1℃培養7 d～14 d后，刮取平板上的菌落，將其懸浮于無(wú)菌生理鹽水中，充分混勻后，用適量無(wú)菌生理鹽水調整菌懸液濃度，用比濁法菌懸液中孢子的最終濃度不低于5.0×10⁷ CFU/mL。

5.1.2注射

小鼠40只，雌雄各半，分別隨機分成4組（每組10只），包括雄性小鼠菌懸液滅活對照組、雄性小鼠菌懸液組、雌性小鼠菌懸液滅活對照組、雌性小鼠菌懸液組，每只小鼠注射0.2mL，使每只小鼠注射的孢子量不少于10⁷ CFU/只。

5.1.3觀(guān)察

動(dòng)物腹腔注射后每天觀(guān)察1次，至少觀(guān)察21 d。

觀(guān)察動(dòng)物出現下列（但不限于）異常的情況：（1）皮膚和毛；（2）眼睛和粘膜；（3）呼吸系統；（4）肢體活動(dòng)；（5）行為方式；（6）特別注意觀(guān)察出現振顫、抽搐、腹瀉、嗜睡、流涎和昏迷等現象；（7）體重：注射前及注射后每周稱(chēng)量所有小鼠的體重，并測量實(shí)驗期間死亡的、觀(guān)察期內存活的、最終處死的小鼠均需稱(chēng)重。若小鼠的存活時(shí)間超過(guò)1d，記錄其體重變化；（8）盡可能精確記錄小鼠的死亡時(shí)間。

5.2經(jīng)口灌胃

5.2.1菌種活化與菌懸液制備

除制備濃度不小于2.5×10⁸ CFU/mL的菌懸液外，其他操作步驟同5.1.1。

5.2.1 灌胃

小鼠40只，雌雄各半，分別隨機分成4組（每組10只），包括雄性小鼠菌懸液滅活對照組、雄性小鼠菌懸液組、雌性小鼠菌懸液滅活對照組、雌性小鼠菌懸液組，以2.0 mL／100g·BW的劑量給小鼠灌胃，灌胃前禁食一夜，灌胃后3～4h喂食。

5.2.2 觀(guān)察

同5.1.3。

6  結果與報告

對5.1和5.2的實(shí)驗結果進(jìn)行統計學(xué)分析，并進(jìn)行評價(jià)，包括以下內容：

擬評價(jià)菌株對動(dòng)物體重的影響是否有統計學(xué)意義；

動(dòng)物出現異常特征的時(shí)間及癥狀描述、出現異常的動(dòng)物數目等，包括每只動(dòng)物的死亡時(shí)間；

受試物組動(dòng)物在實(shí)驗期間未出現中毒癥狀或死亡，且對其生長(cháng)發(fā)育等影響無(wú)統計學(xué)意義，即可判定該菌種無(wú)致病性；受試物組動(dòng)物在試驗期間出現中毒癥狀或死亡，或實(shí)驗期間其生長(cháng)發(fā)育受到影響，即可判定該菌種具有致病性。 

附錄C

(規范性附錄)

    保健食品用酵母的致病性試驗方法

1  范圍

    本方法規定了保健食品用酵母的致病性試驗方法。

    本方法適用于保健食品用酵母的致病性評價(jià)。

2  設備和材料

除微生物實(shí)驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：

2.1  培養箱：28 ℃±1 ℃。

2.2  電子天平：感量0.1 g。

2.3  錐形瓶：容量500 mL。

2.4  無(wú)菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）。

2.5  顯微鏡：10×～100×。

2.6  微量移液器及槍頭：1.0 mL。

2.8  比濁儀。

2.9  注射器：1.0 mL。

2.10 小鼠灌胃針頭。

2.11 溫濕度計。

2.12 接種針。

2.13 Class II生物安全柜

3  培養基和試劑

3.1  麥芽汁瓊脂平板：商品化培養基按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)用蒸餾水配制，充分加熱溶解后分裝，121℃高壓滅菌15 min，制備麥芽汁瓊脂平板，備用。

3.2  0.85%無(wú)菌生理鹽水：商品化的生理鹽水，或8.5gNaCl溶于1000mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15 min，備用。

4  實(shí)驗動(dòng)物

選用昆明或ICR健康小鼠，雌雄各半，體重18.0g～22.0 g。

5  操作步驟

    所有擬評價(jià)的菌株均必須進(jìn)行腹腔注射和經(jīng)口灌胃兩種途徑染毒動(dòng)物，評價(jià)菌株對動(dòng)物的致病性。

5.1 腹腔注射

5.1.1 菌種活化與菌懸液制備

將送檢菌種接種麥芽汁瓊脂平板，28℃±1℃培養2 d～7 d后，刮取平板上的菌落，將其懸浮于無(wú)菌生理鹽水中，充分混勻后，用適量無(wú)菌生理鹽水調整菌懸液濃度，用比濁調整菌懸液中菌的最終濃度不低于5.0×10⁷ CFU/mL。

5.1.2注射

小鼠40只，雌雄各半，分別隨機分成4組（每組10只），包括雄性小鼠菌懸液滅活對照組、雄性小鼠菌懸液組、雌性小鼠菌懸液滅活對照組及雌性小鼠菌懸液組，每只小鼠注射0.2mL，使每只小鼠注射的菌量不少于10⁷ CFU/只。

5.1.3觀(guān)察

動(dòng)物腹腔注射后每天觀(guān)察1次，至少觀(guān)察21d。

觀(guān)察動(dòng)物出現下列（但不限于）異常情況：（1）皮膚和毛；（2）眼睛和粘膜；（3）呼吸系統；（4）肢體活動(dòng)；（5）行為方式；（6）特別注意觀(guān)察出現振顫、抽搐、腹瀉、嗜睡、流涎和昏迷等現象；（7）體重：注射前及注射后每周稱(chēng)量所有小鼠的體重，并測量實(shí)驗期間死亡的、觀(guān)察期內存活的、最終處死的小鼠均需稱(chēng)重。若小鼠的存活時(shí)間超過(guò)1d，記錄其體重變化；（8）盡可能精確記錄小鼠的死亡時(shí)間。

5.3經(jīng)口灌胃

5.3.1菌種活化與菌懸液制備

除制備菌懸液濃度不小于2.5×10⁸ CFU/mL外，其他操作步驟同5.1.1。

5.3.1 灌胃

小鼠40只，雌雄各半，分別隨機分成4組（每組10只），包括雄性小鼠菌懸液滅活對照組、雄性小鼠菌懸液組、雌性小鼠菌懸液滅活對照組及雌性小鼠菌懸液組，以2.0 mL／100g·BW的劑量給小鼠灌胃，灌胃前應禁食一夜，灌胃后3～4h喂食。

5.3.2 觀(guān)察

同5.1.3。

6  結果與報告

對5.1和5.2的實(shí)驗結果進(jìn)行統計學(xué)分析，并進(jìn)行評價(jià)，包括以下內容：

擬評價(jià)菌株對動(dòng)物體重的影響是否有統計學(xué)意義；

動(dòng)物出現異常特征的時(shí)間及癥狀描述、出現異常的動(dòng)物數目等，包括每只動(dòng)物的死亡時(shí)間；

受試物組動(dòng)物在實(shí)驗期間未出現中毒癥狀或死亡，且對其生長(cháng)發(fā)育等影響無(wú)統計學(xué)意義，即可判定該菌種無(wú)致病性；受試物組動(dòng)物在試驗期間出現中毒癥狀或死亡，或實(shí)驗期間其生長(cháng)發(fā)育受到影響，即可判定該菌種具有致病性。